Lauréate du baccalauréat en 1899, Clotilde Deflandre poursuit ses études à la Faculté des Sciences de Paris.
Titulaire d’un doctorat ès sciences en 1903, elle entame une carrière dans l’enseignement secondaire tout en continuant ses recherches. Nommée professeure de sciences au collège de jeunes filles de Roubaix, elle profite de la proximité géographique avec la Faculté mixte de médecine et de pharmacie de Lille et du lien unissant son mentor Augustin Gilbert et le professeur lillois Hyppolyte Surmont pour préparer un doctorat de médecine qu’elle soutient en 1910.
Elle semble poursuivre sa carrière d’enseignante jusqu’à son mariage en 1921 avec Léon Dufour, médecin à Fécamp, fondateur de La Goutte de lait. Elle exerce alors la médecine avec son époux. Quelques temps après le décès de celui-ci en 1928, elle effectue de nouvelles recherches scientifiques et publie des articles en 1931-1932 avec le docteur Gaston Roussel, fondateur des Usines Chimiques des Laboratoires Français (UCLAF).